Gene cloning ay ang pagkilos ng paggawa ng mga kopya, o mga panggagaya, ng isang solong gene. Kapag nakilala ang isang gene, maaaring gamitin ang mga panggagaya sa maraming lugar ng biomedical at pang-industriya na pananaliksik. Ang genetic engineering ay ang proseso ng cloning genes sa mga bagong organismo o binabago ang sequence ng DNA upang baguhin ang produkto ng protina. Ang genetic engineering ay nakasalalay sa ating kakayahang isagawa ang mga sumusunod na mahahalagang pamamaraan.
01 Polymerase Chain Reaction
02 Restriction Enzymes
Ang pagkatuklas ng mga enzymes na kilala bilang endonucleases sa paghihigpit ay mahalaga sa engineering engineering . Ang mga enzymes na ito ay pinutol ang DNA sa mga tiyak na lokasyon batay sa sequence ng nucleotide. Daan-daang iba't ibang mga enzymes sa paghihigpit , na may kakayahang mag-cut ng DNA sa isang natatanging site, ay nahiwalay mula sa maraming iba't ibang mga strain ng bakterya. Ang DNA cut na may enzyme sa paghihigpit ay gumagawa ng maraming mas maliit na mga fragment, na may iba't ibang laki. Ang mga ito ay maaaring ihiwalay gamit ang gel electrophoresis o chromatography.
03 Electrophoresis
Ang paglilinis ng DNA mula sa kultura ng cell, o pag-cut ito gamit ang mga enzymes sa paghihigpit ay hindi gaanong magagamit kung hindi natin maipakita ang DNA - ibig sabihin, maghanap ng isang paraan upang tingnan kung mayroon o hindi ang iyong kunin ay naglalaman ng anumang bagay, o kung anong laki ang mga fragment mo i-cut ito sa. Ang isang paraan upang gawin ito ay sa gel electrophoresis. Ang mga gels ay ginagamit para sa iba't ibang mga layunin, mula sa pagtingin sa pag-cut ng DNA upang makita ang mga pagsingit ng DNA at mga knockout.
04 Sumali sa Dalawang piraso ng DNA
Sa genetic research, madalas na kinakailangan na mag-link ng dalawa o higit pang mga indibidwal na mga hibla ng DNA, upang lumikha ng isang recombinant strand, o isara ang isang pabilog na piraso na na-cut na may mga enzymes sa paghihigpit. Ang mga enzyme na tinatawag na DNA ligases ay maaaring lumikha ng mga covalent bond sa pagitan ng mga chain nucleotide. Ang enzymes DNA polymerase I at polynucleotide kinase ay mahalaga din sa prosesong ito, para sa pagpuno sa mga puwang o phosphorylating ang 5 'dulo, ayon sa pagkakabanggit.
05 Pinili ng Maliit na Self-Replicating DNA
Maliit na pabilog na piraso ng DNA na hindi bahagi ng isang bacterial genome, ngunit may kakayahang makopya sa sarili, ay tinatawag na plasmids. Ang mga plasmid ay kadalasang ginagamit bilang mga vectors upang maghatid ng mga gene sa pagitan ng mga mikroorganismo. Sa biotechnology, kapag ang gene ng interes ay napalaki at ang parehong gene at plasmid ay pinutol ng mga enzymes ng paghihigpit, ang mga ito ay pinagtitibay ng magkasanib na pagbuo ng tinatawag na recombinant DNA. Viral (bacteriophage) DNA ay maaari ding gamitin bilang isang vector, tulad ng maaari cosmids, recombinant plasmids na naglalaman bacteriophage genes.
06 Paraan upang Ilipat ang isang Vector Sa isang Cell ng Host
Ang proseso ng paglilipat ng genetic na materyal sa isang vector tulad ng isang plasmid, sa mga bagong host cell, ay tinatawag na pagbabagong-anyo. Ang pamamaraan na ito ay nangangailangan na ang mga host cell ay napakita sa isang pagbabago sa kapaligiran na gumagawa ng mga ito "karampatang" o pansamantalang natatagusan sa vector. Ang electroporation ay isa sa mga ganitong pamamaraan. Ang mas malaki ang plasmid, mas mababa ang kahusayan kung saan ito ay kinuha ng mga cell. Ang mas malaking mga segment ng DNA ay mas madaling kopya gamit ang bacteriophage, retrovirus o iba pang mga vectors vectors o cosmids sa isang paraan na tinatawag na transduction. Ang Phage o viral vectors ay kadalasang ginagamit sa regenerative medicine ngunit maaaring maging sanhi ng pagpasok ng DNA sa mga bahagi ng aming chromosomes kung saan hindi natin ito nais, na nagiging sanhi ng mga komplikasyon at kahit na kanser.
07 Mga Paraan Upang Piliin ang Mga Organismo ng Transgenic
Hindi lahat ng mga cell ay magdadala ng DNA sa panahon ng pagbabagong-anyo. Mahalaga na may paraan ng pag-detect ng mga ginagawa nito. Sa pangkalahatan, ang mga plasmid ay nagdadala ng mga gene para sa antibyotiko na paglaban at ang mga selulang transgeniko ay maaaring mapili batay sa pagpapahayag ng mga gene at ang kanilang kakayahang lumaki sa mga media na naglalaman ng antibyotiko. Ang mga alternatibong paraan ng pagpili ay nakasalalay sa pagkakaroon ng iba pang mga reporter ng mga protina tulad ng x-gal / lacZ system, o berde fluorescence protein, na nagpapahintulot sa pagpili batay sa kulay at pag-ilaw, ayon sa pagkakabanggit.