Ang mga pagsasaayos sa alinman sa mga bahagi ng isang reaksyon ng Polymerase Chain Reaction (PCR) ay maaaring baguhin ang kalidad ng kinalabasan, alinman sa pamamagitan ng pagpapabuti o pagbawas ng produkto na ani at kalidad o sa pamamagitan ng pagpapabuti ng pagtitiyak at sensitivity ng reaksyon. Ang mga parameter na nakakaimpluwensya sa resulta ay maaaring maging pisikal (ie, temperatura, beses ng cycle) o kemikal (ibig sabihin, template konsentrasyon, uri ng enzyme na ginamit). Ang mga sumusunod ay maraming susi na nakakaimpluwensya sa tagumpay ng PCR.
01 Malinis na Mga Kundisyon ng Laboratoryo
Dahil ang PCR ay may kakayahang maghanap ng isang molekula ng DNA, mahalaga na mapanatili ang mga malinis na kondisyon sa laboratoryo. Laging magsuot ng sariwang guwantes, gumamit ng sterile glassware, mga tubo at mga tip ng pipette at sterile solution, at linisin ang lugar ng trabaho bago magsimula ang trabaho.
Palaging isama ang mga reaksyon ng kontrol, walang template DNA at walang enzyme, upang matiyak na ang mga resulta ay tunay na dahil sa paglaki ng tamang sample.
Tinitiyak ng karamihan ng mga tao na magkaroon ng kanilang sariling mga hanay ng mga solusyon na hindi ibinabahagi upang gawing mas madali ang pag-troubleshoot at ang mga pipet na itinalaga ay karaniwang itinatabi para sa PCR lamang. Ang mga DNase at RNase-free PCR tubes, mga aerosol-resistant pipette tip at nagtatrabaho sa isang fume hood na may UV light ay mga paraan upang mabawasan ang mga problema.
02 Mga Bahagi ng Kemikal
- Magkaroon ng 18 hanggang 24 na mga base
- Wala pang sekundaryong istraktura (ibig sabihin, mga balbas ng buhok)
- May balanseng pamamahagi ng mga pares ng G / C at A / T
- Ay hindi komplimentaryong sa bawat isa sa 3-paa dulo
- Magkaroon ng mga temperatura ng pagtunaw (Tm) tungkol sa 5-10 degrees Celsius sa ibaba ng temperatura ng pagsusubo, na karaniwan ay sa pagitan ng 55 at 65 degrees Celsius
Ang Tm para sa parehong mga primer ay dapat ding magkatulad para sa mga pinakamahusay na resulta.
03 Reaction Mix: Template at Primers
Ang pinakamainam na mga concentrasyon ng panimulang aklat ay sa pagitan ng 0.1 at 0.6 micromoles / L. Ang halaga ng template ay nag-iiba depende sa uri ng DNA (tao, bacterial, plasmid).
Sa napakababang halaga ng template, may iba pang mga estratehiya upang mapabuti ang mga resulta, tulad ng nadagdagan na mga numero ng pag-ikot o paggamit ng "mainit na pagsisimula." Laging subukan ang mga bagong primer na may positibong kontrol reaksyon, upang matiyak na gumagana ang mga ito sa ilalim ng iyong partikular na mga kondisyon sa experimental.
04 Reaction Mix: Enzyme Activity
Ang konsentrasyon ng MgCl2 sa reaksyon ay maaaring maka-impluwensya sa kinalabasan ng PCR at maaaring maglagay ng isang mahalagang papel sa mas masayang reaksiyon. Magnesium cation ay bumubuo ng mga natutunaw na complex na may mga dNTP upang makabuo ng aktwal na substrate na kinikilala ng polymerase enzyme.
Ang pantay na halaga ng lahat ng apat na dNTPs ay tumutulong din na mabawasan ang rate ng error sa polymerase. Ang ilang mga additives tulad ng betaine, BSA, detergents, DMSO, gliserol, at pyrophosphatase ay maaari ring makaapekto sa enzyme pagtitiyak o kahusayan sa reaksyon.
05 Uri ng Thermocycler
Kapag namimili ng mga kagamitan sa laboratoryo, tandaan na ang ilang mga thermocycler ay mas tumpak kaysa sa iba sa pagpapanatili ng eksaktong, nais na mga temperatura.
Ito ay isang lugar na kung saan ang pagpunta cheap ay hindi magbabayad sa katagalan kapag ikaw ay nahaharap sa isang maselan reaksyon o paggamit primers na nangangailangan ng isang makitid na hanay ng temperatura pagsusubo.
Ang mga tubong reaksyon ng tabing ng manipis na idinisenyo upang umangkop sa tumpak na brand ng thermocycler na iyong ginagamit, tulungan din na i-optimize ang mga temperatura ng reaksyon.
06 Mga Setting ng Ikot
Ang nadagdag na ani ay maaaring makamit sa pamamagitan ng pagdaragdag ng oras ng extension tungkol sa bawat 20 na cycle, upang makabawi para sa mas kaunting enzyme upang palakasin ang higit pang template. Karaniwan, mas mababa sa 40 na cycle ay sapat na upang palakasin ang mas mababa sa 10 mga template molecule sa isang konsentrasyon na sapat na malaki upang tingnan sa isang ethidium bromide-stained agarose gel .