Ang antas ng kinakailangang protina ng kadalisayan ay depende sa inilaan na paggamit ng protina.
Para sa ilang mga application, sapat na krudo ang kinuha. Gayunpaman, para sa iba pang paggamit, tulad ng sa mga pagkain at parmasyutiko, kailangan ang mataas na antas ng kadalisayan. Upang makamit ang ilang mga pamamaraan ng pagdalisay ng protina ay kadalasang ginagamit, sa isang serye ng mga hakbang sa pagdalisay.
Ang bawat hakbang sa pagdalisay ng protina ay karaniwang nagreresulta sa ilang antas ng pagkawala ng produkto. Samakatuwid, ang isang perpektong diskarte sa paglilinis ng protina ay isa kung saan ang pinakamataas na antas ng paglilinis ay naabot sa pinakamaliit na hakbang. Ang pagpili kung aling mga hakbang ang gagamitin ay nakasalalay sa laki, singil, solubility at iba pang mga katangian ng target na protina. Ang mga sumusunod na diskarte ay pinaka-angkop para sa paglilinis ng isang solong cytosolic protein. Ang paglilinis ng cytosolic protein complexes ay mas kumplikado at karaniwan ay nangangailangan na magamit ang iba't ibang mga pamamaraan.
Mga Unang Hakbang para sa Paglilinis ng Protein
Ang unang hakbang sa paglilinis ng intracellular (sa loob ng cell) na mga protina ay ang paghahanda ng isang krudo na katas .
Ang ekstrang ay naglalaman ng isang kumplikadong halo ng lahat ng mga protina mula sa cytoplasm ng cell, at ilang karagdagang macromolecules, cofactors, at nutrients. Ang krudo ay maaaring gamitin para sa ilang mga application sa biotechnology, gayunpaman, kung ang kadalisayan ay isang isyu, dapat sundin ang mga hakbang sa paglilinis.
Ang krudo protina extracts ay inihanda sa pamamagitan ng pag-alis ng cellular mga labi na nabuo sa pamamagitan ng cell lysis, na nakamit gamit ang mga kemikal at enzymes , sonication o isang French Press. Ang mga labi ay inalis sa pamamagitan ng centrifugation, at ang supernatant ay nakuhang muli. Ang mga mahahalagang paghahanda ng mga protinang ekstraselular ay maaaring makuha sa pamamagitan lamang ng pag-alis ng mga selula sa pamamagitan ng centrifugation.
Para sa ilang mga biotechnology application, mayroong isang demand para sa termostable enzymes : Enzymes na maaaring magparaya ng mataas na temperatura nang walang pagtanggi, at habang pinapanatili ang isang mataas na tiyak na aktibidad. Ang mga organismo na gumagawa nito ay tinatawag na extremophiles. Ang isang madaling diskarte sa paglilinis ng isang init-lumalaban protina ay upang denature ang iba pang mga protina sa halo sa pamamagitan ng pag-init, pagkatapos ay pinapalamig ang solusyon (sa gayon ay nagbibigay-daan sa termostable enzyme upang reporma o redissolve, kung kinakailangan.
Mga Hakbang sa Paglilinis ng Intermediate
Sa nakaraan, isang pangkaraniwang ikalawang hakbang sa paglilinis ng isang protina mula sa isang magaspang na kunin ay sa pamamagitan ng pag- ulan sa isang solusyon na may mataas na osmotik na lakas (ie mga solusyon sa asin). Ang mga nucleic acids sa crude extract ay maaaring alisin sa pamamagitan ng precipitating aggregates na nabuo sa streptomycin sulpate o protina sulpate.
Ang pag-ulan ng protina ay karaniwang ginagawa gamit ang ammonium sulfate bilang asin.
Ang iba't ibang mga protina ay nananatili sa iba't ibang konsentrasyon ng ammonium sulfate . Sa pangkalahatan, ang mga protina ng mas mataas na molekular na timbang ay namuo sa mas mababang konsentrasyon ng ammonium sulfate. Ang pag-ulan ng asin ay hindi kadalasang humahantong sa isang mataas na purified protina ngunit maaaring makatulong sa pag-aalis ng ilang mga hindi gustong mga protina sa isang halo at pag-isipin ang sample. Pagkatapos ay alisin ang mga asing-gamot sa solusyon sa pamamagitan ng dyalisis sa pamamagitan ng porous selulusa na tubing, pagsasala, o kromatograpya ng pagbubukod ng gel.
Ang mga modernong biotech na mga protocol ay kadalasang sinasamantala ng maraming mga magagamit na kit na pang-komersyal na nagbibigay ng mga solusyon na handa para sa mga standard na pamamaraan. Ang paglilinis ng protina ay kadalasang ginagawa gamit ang mga filter at naghanda ng mga haligi ng pagsasala ng gel. Ang kailangan mo lang gawin ay sundin ang mga tagubilin at idagdag ang tamang dami ng tamang solusyon at maghintay ng tinukoy na tagal ng panahon habang kinokolekta ang nabanggit (kung ano ang lumabas sa kabilang dulo ng haligi) sa isang bagong test tube.
- Maaaring i-apply ang mga pamamaraan sa kromatograpikong paggamit ng mga hanay ng bench-top o automated na kagamitan ng HPLC. Ang paghihiwalay ng HPLC ay maaaring gawin sa pamamagitan ng reverse-phase, ion-exchange o mga paraan ng pagbubukod ng laki, at mga sample na nakita ng diode array o laser technology. Gg
Pagmamasid ng Protein at Pagtatasa ng Paglilinis
- Ang reverse-phase chromatography (RPC) ay naghihiwalay sa mga protina batay sa kanilang mga kamag-anak na hydrophobicities . Ang pamamaraan na ito ay lubos na pumipili ngunit nangangailangan ng paggamit ng mga organic na solvents. Ang ilang mga protina ay permanenteng denatured sa pamamagitan ng solvents at mawawala ang pag-andar sa panahon ng RPC. Samakatuwid ang pamamaraan na ito ay hindi inirerekomenda para sa lahat ng mga application, lalo na kung kinakailangan para sa target na protina upang mapanatili ang aktibidad.
- Ang Ion-exchange chromatography ay tumutukoy sa paghihiwalay ng mga protina batay sa singil . Ang mga haligi ay maaaring maging handa para sa exchange ng anion o palitan ng kation. Ang mga hanay ng palitan ng anion ay naglalaman ng isang nakapirming bahagi na may positibong singil na umaakit ng mga negatibong sisingilin ng mga protina. Ang mga haligi ng kation exchange ay ang reverse, negatibong sisingilin kuwintas na maakit ang positibo sisingilin protina. Ang pag-alis ng (mga) target na protina ay ginagawa sa pamamagitan ng pagbabago ng pH sa haligi, na nagreresulta sa isang pagbabago o neutralisasyon ng mga sisingilin na grupo ng pagganap ng bawat protina.
- Ang chromatography ng paghihiwalay sa laki (ang pagsasala ng gel ) ay naghihiwalay ng mga mas malalaking protina mula sa mga maliliit dahil ang mas malaking mga molecule ay mas mabilis na maglakbay sa pamamagitan ng cross-linked polymer sa chromatography column. Ang mga malalaking protina ay hindi umaangkop sa mga pores ng polimer samantalang ang mas maliliit na protina ay ginagawa, at mas matagal na maglakbay sa hanay ng chromatography, sa pamamagitan ng kanilang mas direktang ruta. Ang Eluate ay nakolekta sa isang serye ng mga tubo na naghihiwalay sa mga protina batay sa elusyon oras. Ang pagsasala ng gel ay isang kapaki-pakinabang na tool para sa pagtuon ng isang sample ng protina dahil ang target na protina ay nakolekta sa isang mas maliit na dami ng elusyon kaysa sa una ay idinagdag sa haligi. Ang mga katulad na pamamaraan ng pagsasala ay maaaring gamitin sa panahon ng malakihang produksyon ng protina dahil sa kanilang pagiging epektibo sa gastos.
- Ang kahalagahan ng chromatography ay isang kapaki-pakinabang na pamamaraan para sa "buli" o pagkumpleto ng proseso ng paglilinis ng protina. Ang kuwintas sa haligi ng chromatography ay naka-link sa mga ligong na nakagapos sa espesipikong protina. Pagkatapos ay aalisin ang protina mula sa haligi sa pamamagitan ng paglilinis na may solusyon na naglalaman ng mga libreng ligand. Ang pamamaraang ito ay nagbibigay ng mga purest resulta at pinakamataas na partikular na aktibidad kumpara sa iba pang mga diskarte.
- Ang SDS-PAGE ay polyacrylamide gel electrophoresis, na ginagawa sa presensya ng SDS (sodium dodecyl sulfate) na nagbubuklod sa mga protina na nagbibigay sa kanila ng malaking netong negatibong singil. Dahil ang mga singil ng lahat ng mga protina ay medyo katumbas, ang pamamaraang ito ay naghihiwalay sa kanila halos lahat batay sa sukat. Ang SDS-PAGE ay kadalasang ginagamit upang masubukan ang kadalisayan ng protina pagkatapos ng bawat hakbang sa isang serye. Bilang unti-unti na inalis na mga protina mula sa timpla, ang bilang ng mga banda na nakikita sa SDS-PAGE gel ay nabawasan, hanggang sa mayroong isang banda na kumakatawan sa nais na protina.
- Immunoblotting ay isang protina visualization pamamaraan na inilalapat sa kumbinasyon na may affinity chromatography. Ang mga antibodies para sa isang partikular na protina ay ginagamit bilang mga ligand sa haligi ng chromatography ng affinity. Ang target na protina ay mananatili sa haligi, pagkatapos ay aalisin sa pamamagitan ng pag-aalis ng haligi na may solusyon ng asin o iba pang mga ahente. Ang mga antibodies na naka-link sa radioactive o dye labels ay tumutulong sa pagtuklas ng target na protina sa sandaling ito ay hiwalay mula sa natitirang bahagi ng pinaghalong.
Pinagmulan:
Zubay G. 1988. Biochemistry, 2nd Edition. Macmillan Publishing Co., New York, NY, USA.
Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Protein Purification Handbook, Edition AB. Amersham Pharmacia Biotech Inc. New Jersey, USA. http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf.